组织分离是一种用子实体的某一部分来分离菌种的方法。因为组织分离法操作简便，不易带入杂菌，容易获得纯菌种。后代不易发生遗传重组等变异，能保持原菌株的优良特性。因此组织分离是目前应用最广泛的分离手段。
组织分离的方法：
1.选择无污染并菇形健壮的蘑菇幼菇（6分成熟），采摘后及时放入灭过菌的纸袋中带回接种室，连同母种用试管培养基等用品一起放入接种箱或超净工作台内消毒。
2.先用75%的酒精消毒双手，将镊子、接种铲、小刀等接种用用具用酒精消毒，用酒精棉擦一下，拿到酒精灯上烧一下。
3.用略干的酒精棉球将子囊果菌柄特别是基部与土壤交界处的灰尘或泥土擦拭干净，擦拭过程中及时更换酒精棉球。
4.切开羊肚菌，切取菌柄与菌盖交接处组织较厚的部位，什么地方肉厚用什么地方，切取菌柄2-5mm组织块2-3块，用镊子夹住，将组织块在无菌水中涮一下，并在酒精灯上快速过几下。（过程中少用升汞或酒精消毒，避免将羊肚菌菌丝全部杀死。）
5.将组织块放入培养皿培养，在22-25℃避光培养，2-3天萌发出新菌丝，新菌丝长到培养基上，48小时后，此时菌丝长约0.2-0.4 cm，菌丝粗壮；56-72小时后，成功萌发的菌丝将长至0.5-1.5cm长，菌丝纤细，无色，不浓密，前端近似整体，根根分明，此时可挑取菌落尖端进行挑出纯化。
6.纯化后的试管要贴上标签，注明接种日期和品种的名称。
7.纯化的羊肚菌12 h左右，可见到从接种块萌发到培养基上的新生菌丝，7天左右长满试管，并出现白色菌核，10天左右，小菌核由初始的白色，逐渐变浅黄、变大；培养15天左右后可放4度冰箱保存。
得到纯菌种后进行转管操作，15-18天菌丝即可长满试管，挑选菌丝健旺、无污染的菌管再进行转接扩繁，须经出菇试验合格后用于生产。
羊肚菌皮薄，遇水，酒精不会萌发。根据以上方法，可进行多次试验。（从业者需根据实验操作来调整相关细节，以上操作仅供参考。）
注：羊肚菌作为一种子囊菌，与其他食用菌相比最大缺点是容易退化，变异和生霉。因此，分离菌种要进行出菇和比较试验。
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