2023年12 月 28 日，来自中科院天津工业生物技术研究所的李德茂团队发表最新研究。该团队通过阻断副产物合成、以及优化发酵条件等方法，基于Fusarium venenatum镰刀菌开发出了低排放、高产率的真菌蛋白生产方法。

 

结果表明，与野生型菌株相比，经过工程化改造的菌株其菌蛋白合成率提高 57%，碳转化率提高 62%，蛋白质含量提高 57%，同时二氧化碳排放量显著降低。

相关论文Efficient Mycoprotein Production with Low CO₂Emissions through Metabolic Engineering and Fermentation Optimization of Fusarium venenatum已在线发表于Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

 

Fusarium venenatum（以下简称 “F. venenatum”）产生的真菌蛋白是一类优质的动物/植物源蛋白质替代品。其中，由F. venenatumA3/5 菌株所产的真菌蛋白 Quorn 已经完成产业转化，在全球范围内进入市场销售。然而，基于该方法的菌蛋白产量较低，因此近年以来，众多研究者围绕着F. venenatum的工程化改造以及发酵工程开展优化工作。

糖酵解（glycolysis）是指细胞在无氧条件下，葡萄糖在细胞质中被分解成为丙酮酸的过程。作为该过程的最终产物，丙酮酸又在细胞整个代谢过程中发挥着举足轻重的作用。

 

一些早期研究已经证实，改变真菌中丙酮酸的代谢途径可以显著提高目标化学品的产量。而在实际研究过程中，研究者还在F. venenatum的发酵过程中发现大量的副产物乙醇。考虑到乙醇是丙酮酸代谢途径中的下游产物，那么在此之前，其代谢途径中还包括利用丙酮酸脱羧酶将丙酮酸催化成为二氧化碳和乙醛。

该过程中，排放出的二氧化碳无疑是限制碳转化的重要因素之一。因此，研究者试图通过编辑丙酮酸脱羧酶基因从而阻断后续代谢通路，其不仅能够显著提高真菌蛋白合成的碳转化率，同时还有利于减少碳排放。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

为了验证上述策略的可行性，研究团队基于 CRISPR/Cas9 工具针对 F. venenatum 基因组中丙酮酸脱羧酶基因 FvPDC6 等进行修改，从而获得工程化菌株 ΔFvPDC6。

 

结果如研究者所料，在 1L 摇瓶中发酵 96 小时后，菌株 ΔFvPDC6 中没有检测到乙醇产生，而野生型中的乙醇产量达到 5.80g/L。通过进一步分析发现，发酵 96 小时后 ΔFvPDC6 的生物量产量已达到 6.23g/L，葡萄糖消耗仅为 18.5g/L。与之相比，野生型菌株的产量为 6.11g/L，但是葡萄糖消耗量已达到 31.0g/L。这些数据证实，FvPDC6 是主要的丙酮酸脱羧酶基因，并且其可以作为提升真菌蛋白合成效率的突破点之一。

 

值得注意的是，研究者发现经过不同的发酵时间之后，ΔFvPDC6 与野生型菌株之间的蛋白质增量数据与时间不成比例。这就说明在修改 FvPDC6 之后，还有其他未知因素影响了工程化菌株的蛋白质产量。

 

为此，研究者进一步对野生型和 ΔFvPDC6 菌株进行了转录组学和代谢组学分析。分析结果显示，FvPDC6 基因修饰后导致有机酸水平显著上调，其中包括乙酰丙酸、辛二酸、丙酮酸等。然而与乙醇不同的是，这些富集的有机酸仍然以非常低的水平存在。

 

除此之外，富集的丙酮酸又增强了糖异生途径，因此，研究者考虑通过过表达丙酮酸羧化酶基因 FvPYC 和删除磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因 FvPCK 的方法来阻断糖异生途径，从而补充草酰乙酸盐并固定二氧化碳。由此，获得了菌株 ΔFvPPOEP。

▲图丨糖异生途径的转录组学和代谢组学分析（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

 

在综合考虑碳转化率与蛋白质产量增加数据之后，研究者认为在 5L 的反应器中进行 48 小时发酵是最佳选择。因此在该条件下，经过上述改造的工程化菌株 ΔFvPPOEP 的菌蛋白合成率、碳转化率和蛋白质含量与野生型菌株相比分别提高了 16%、73% 和 25%。

 

在此之后，研究团队尝试向生物反应器中添加 ZnSO4以提高菌蛋白合成速率，最终确定其添加量为 20mg/L。

 

总体而言，经过发酵工艺优化之后，工程化菌株 ΔFvPPOEP 的菌蛋白合成率、碳转化率和蛋白质含量与野生型菌株相比分别提高了 57%（0.212 vs 0.135g/L·h）、62%（0.351 vs 0.217g/g）和 57%（61.9 vs 39.4%）。

 

上述数据表明，在相同蛋白产量的情况下，经工程化改造的F. venenatum菌株在发酵过程中葡萄糖消耗可有效减少 61%，并且发酵周期缩短一半以上，这极大地促进了基于F. venenatum的菌蛋白生产效率。不仅如此，考虑到锌在人类营养和健康中的重要作用，该发酵方法或将在未来为可食用富锌菌蛋白的合成提供方向。（来源：生辉SciPhi）